整体层析柱助力AAV下游工艺

近年来，重组腺相关病毒（rAAV）的基因治疗在单基因的罕见病治疗方面取得了重大进展。据不完全统计，目前全球超过200多项AAV相关的基因疗法正在开发临床，主要集中在血友病、Duchenne肌营养不良症和眼科疾病等遗传性罕见疾病治疗。
AAV疗法在国内起步较晚，目前还仅仅有四款药物的IND申请获批，多个药物仍然停留在临床前的工艺开发过程中。

AAV产品属于临床转化的范畴，很多早期的研究都是在实验室完成的概念验证，对AAV的血清类型、数量和质量进行全面的筛选，建立初步生产流程。但进入临床前阶段往往忽视了这些初步建立的生产流程很难再大规模进行工业化应用，让多个具有药用价值的项目徘徊不前，反复进行生产工艺的摸索，极大地影响了其进入临床阶段的效率。

从常规的AAV工艺来看，实验室规模的细胞培养多是使用方瓶或者细胞工厂，但是工业化阶段多是在大型反应器中进行悬浮培养。澄清阶段小规模实验室使用离心方式，大规模多使用深层过滤。实验室阶段的纯化主要使用氯化铯或碘沙醇，以繁琐的密度超速离心方法进行空衣壳的分离，而大规模多是以浓缩和层析方式为主。因此这些工艺的差异性需要在产品开发阶段始终考量，让产品的开发快速从实验室阶段转化到临床阶段。

以下游工艺开发为例，需要充分考虑线性可扩展性挑战，线性可扩展性可以针对每个单元操作具有不同的理解，离心、超速离心和透析等方法的线性放大型最差，线性可扩展，层析纯化法具有最好的线性放大效率被广泛应用于蛋白及基因治疗产品的杂质分离，但膜层析及一些新型的填料同样也缺乏比较成熟的线性放大模型。

2020年11月，赛多利斯成功完成了对层析专家BIA Separations公司（领先的Monolith整体柱制造商）的收购。整体柱（monolith）作为一种对流相互作用介质（CIM，Convective Interaction Media），在工艺流速和清洁验证方面具有显著优势，可以有效支持工艺线性放大型，并针对AAV药物开发出稳健、快速、有效的rAAV病毒纯化平台，可用于不同AAV病毒血清型的大规模纯化和质量控制。

以rAAV9腺病毒载体为例，裂解收获物和上清液首先在CIMmultus™ OH柱上进行捕获和浓缩，然后在CIMmultus™ SO3柱上进行中间处理，最后在CIMmultus™ QA柱上进一步纯化，其产物收率和纯度均具有有效保证。

CIMmultus™ OH基于疏水特性，可以在磷酸钾缓冲液体系使用线性洗脱可以有效捕获病毒颗粒，同时也可以对病毒颗粒进行浓缩，同时比较用3 M中性磷酸钠以1:1的比例稀释的裂解性和分泌型的AAV的工艺性能并无区别。在OH裂解收获物的E1组分进行稀释并酸化，然后在乙酸体系内同样使用线性洗脱的方式，在CIMmultus™ SO3进行进一步的纯化。

空的衣壳病毒颗粒或者含有全长基因以外DNA的病毒载体颗粒去除，是AAV药物纯化的难点和重点，对CIMmultus™ SO3纯化后的AAV病毒颗粒，通过线性梯度法，通过CIMmultus™ OA进一步精纯，可实现与实验室阶段相同的产品纯度，充分显示了整体赛多利斯CIMmultus™整体层析柱对实验室工艺的转化效率，同时也显示了其工业放大性的极大优势。

大白总结

工艺的纵向扩展和缩减建模对于过程开发至关重要，在处理多个目标 rAAV 血清型和 GOI 时，通常需要缩小模型进行初始概念验证，该模型可用于较小的体积和低载体浓度。层析纯化对于使用松散的填料，96孔板高通量的缩小建模相对容易，此外还可以选择小规模包装的整体柱以提高实验效率。

对于深层过滤、切向流过滤、无菌过滤等过滤操作由于缺乏一次性缩减模型而更具挑战性。对于这些步骤，因为平台技术不存在，或者可用于涵盖各种rAAV类型的缩小模型有限，因此每个纯化步骤必须针对特定的rAAV衣壳变体进行定制。此外rAAV 滴度和杂质水平的批次间差异可能导致缩减模型过载或负载不足，并给放大生产带来挑战。同时每种rAAV类型包装效率的变化改变了空衣壳和全rAAV颗粒的产生;因此，对于空衣壳与全rAAV颗粒的比例变化，相同的分离纯化过程并非每次都适用。

因此开发用于概念验证研究和小规模生物工艺的可扩展和微型模型，对于更快的临床前研究和顺利过渡到临床阶段至关重要。考虑到使用rAAV作为新型基因治疗方式的快速增长趋势，必须努力建立强大及可扩展的生产技术，以帮助未来商业化不断增长的需求。

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参考文献

1.  The clinical landscape for AAV gene therapies. Nat. Rev. Drug Discov. 20, 173–174

2.  Adeno-associated viral vector process development challenges in early research & preclinical study. Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(3), 411–420

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